Les sept milieux de laboratoire courants

Une suspicion de typhoïde est une chaîne de décisions qui commence bien avant l’ouverture d’une boîte. Salmonella enterica sérovar Typhi est avalée avec de l’eau ou des aliments contaminés, franchit la muqueuse intestinale, se multiplie dans les ganglions mésentériques et gagne la circulation sanguine. Le patient développe alors une fièvre progressive, des céphalées, un inconfort abdominal, puis, en deuxième semaine, des taches rosées sur le tronc et une rate augmentée. Comme l’organisme est précoce dans le sang et plus tardif dans les selles, le prélèvement dépend de la semaine de la maladie : l’hémoculture est la plus rentable en première semaine, la coproculture ou l’uroculture en deuxième et troisième semaines, et la culture de moelle osseuse — inconfortable mais la plus sensible — est réservée aux cas difficiles. Le point infirmier vient en premier : le prélèvement doit être fait avant la première dose d’antibiotique, car une seule dose peut supprimer l’organisme et transformer un vrai positif en une « absence de croissance » trompeuse. Si le transport est retardé, les selles sont placées en milieu de Cary-Blair, qui garde l’organisme vivant sans le laisser proliférer. Une fois les selles au laboratoire, l’ensemencement direct ne suffit généralement pas. Un gramme de matières fécales contient des centaines de millions de bactéries et Salmonella n’en représente qu’une infime minorité : le prélèvement est donc d’abord mis en bouillon d’enrichissement — classiquement au sélénite F, ou au tétrathionate, ou au Rappaport–Vassiliadis incubé à 42 °C. Le sélénite est réduit par la flore fécale, et les produits formés sont toxiques pour les coliformes tandis que Salmonella survit et se multiplie ; après douze à dix-huit heures à 37 °C, le rapport entre Salmonella et ses concurrents a suffisamment changé pour que le repiquage réussisse. Une incubation trop longue laisse les concurrents reprendre l’avantage : c’est pourquoi le bouillon est repiqué après un délai fixe plutôt que laissé jusqu’à la garde suivante. Le bouillon est ensuite étalé sur des boîtes sélectives et différentielles. La gélose MacConkey montre des colonies pâles, non fermentantes du lactose, car Salmonella ne fermente pas le lactose. La gélose Salmonella–Shigella ajoute des sels biliaires et des colorants qui suppriment les organismes à Gram positif et la plupart des coliformes, et son citrate ferrique réagit au sulfure d’hydrogène produit par Salmonella pour déposer du sulfure de fer noir au centre de chaque colonie ; la gélose au sulfite de bismuth donne des colonies noires à reflet métallique. Une identification présomptive est faite à partir de la boîte, puis la confirmation repose sur des tests biochimiques — gélose triple sucre fer donnant une pente alcaline, un culot acide et un noircissement par le sulfure d’hydrogène, uréase négative, citrate positif et indole négatif — puis sur la sérologie : agglutination de la souche avec les antisérums O somatiques et H flagellaires selon le schéma de Kauffmann–White, ou détection de l’antigène capsulaire Vi. Le test de Widal sur le sérum du patient n’est plus considéré comme fiable. Les laboratoires modernes ajoutent la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF, ou une méthode moléculaire, lorsque la souche est inhabituelle ou lente. Deux conséquences restent à l’infirmière. La première est de santé publique : la typhoïde se transmet par la voie féco-orale ; l’eau sûre, l’évacuation sûre des matières fécales, l’hygiène des mains et l’exclusion d’un patient infectieux de la manipulation des aliments sont donc ce qui arrête une épidémie, et tout cas doit être déclaré. La seconde est le portage chronique : une minorité de patients gardent l’organisme dans la vésicule biliaire et l’excrètent de façon intermittente pendant des années — la femme restée dans l’histoire sous le nom de Mary la Typhoïde en est un exemple — et ces porteurs alimentent de nouvelles épidémies. Le traitement doit donc suivre la sensibilité, car la résistance aux anciens médicaments est répandue, et la vaccination protège la personne qui la reçoit plutôt que la communauté qui l’entoure.

Neisseria gonorrhoeae est un diplocoque à Gram négatif qui vit à l’intérieur des leucocytes polynucléaires du pus. Il provoque chez l’homme une urétrite avec dysurie et écoulement, chez la femme une cervicite souvent silencieuse pouvant remonter en infection pelvienne et en infertilité, et, chez le nouveau-né accouché par un col infecté, une ophtalmie néonatale. Au laboratoire, il est oxydase-positif et extrêmement exigeant, pour une raison nutritionnelle et non seulement environnementale : l’organisme ne sait pas synthétiser plusieurs composés dont il a besoin et doit les trouver déjà formés dans le milieu. Ses exigences sont précises. Il lui faut de l’hémoglobine comme source de fer, de la nicotinamide adénine dinucléotide, le coenzyme aussi appelé facteur V, ainsi que de la cystine ou de la cystéine et d’autres acides aminés. Il lui faut aussi une atmosphère humide enrichie en dioxyde de carbone, généralement cinq pour cent : c’est pourquoi les boîtes sont incubées en jarre à dioxyde de carbone ou en jarre à bougie, à une température maintenue entre 35 et 37 °C. La gélose nutritive simple n’apporte rien de tout cela, et la gélose au sang ordinaire ne suffit souvent pas non plus, car les globules rouges y restent intacts et gardent leurs cofacteurs intracellulaires. La gélose chocolat résout le problème par une étape physique et non chimique. Le sang ajouté à la base est chauffé à environ quatre-vingts degrés Celsius jusqu’à ce que les globules rouges s’hémolysent, c’est-à-dire éclatent, libérant leur hémoglobine et leur nicotinamide adénine dinucléotide intracellulaire dans le milieu. Le résultat n’est pas couleur chocolat à cause du chocolat, mais parce que le sang hémolysé brunit ; le nom est un surnom de laboratoire pour la gélose au sang chauffée. C’est un milieu enrichi, non sélectif : il ne contient aucun inhibiteur, donc tout ce qui peut y pousser y poussera. Cette distinction compte en pratique, car un prélèvement gonococcique contient rarement le seul gonocoque. Un écouvillon urétral chez l’homme peut être presque pur, mais un écouvillon endocervical, rectal ou pharyngé porte une flore normale dense, qui recouvrirait le pathogène sur gélose chocolat ordinaire. Le laboratoire utilise donc une variante sélective, comme le milieu de Thayer–Martin ou de New York City : de la gélose chocolat additionnée de vancomycine pour supprimer les organismes à Gram positif, de colistine pour supprimer les organismes à Gram négatif autres que Neisseria, de nystatine pour les levures et de triméthoprime pour Proteus. Cette boîte est à la fois enrichie et sélective, exactement le chevauchement contre lequel les sept catégories mettent en garde. Pour l’infirmière, les conséquences pratiques sont concrètes. L’écouvillon doit atteindre la boîte rapidement, les boîtes sont ramenées à température ambiante avant l’ensemencement, et le prélèvement voyage en atmosphère enrichie en dioxyde de carbone ; la réfrigération est évitée car le froid tue l’organisme, et un écouvillon gonococcique n’est donc jamais placé au réfrigérateur pour la nuit. La culture reste précieuse car elle donne un résultat de sensibilité, mais l’amplification des acides nucléiques sur les premières urines ou sur un auto-prélèvement vaginal est aujourd’hui plus sensible pour le diagnostic et souvent utilisée en premier. Le traitement est devenu plus difficile à mesure que la résistance s’accumulait : d’abord à la pénicilline par les souches productrices de pénicillinase, puis aux fluoroquinolones, et maintenant avec une sensibilité diminuée aux céphalosporines ; les recommandations changent donc, et le dépistage des partenaires et le conseil de prévention comptent autant que l’ordonnance.

La sélectivité est un artifice chimique exercé sur une population mixte, et chaque inhibiteur agit différemment. Les sels biliaires et le désoxycholate de sodium sont des molécules tensioactives qui désorganisent les membranes des organismes à Gram positif : c’est pourquoi la gélose MacConkey, la gélose Salmonella–Shigella et la gélose au désoxycholate s’emploient sur les selles, prélèvement dans lequel les organismes à Gram positif n’ont pas d’intérêt. Le violet cristal est un colorant qui pénètre la paroi plus mince des Gram positif et bloque la croissance. Le vert malachite, inhibiteur du milieu de Lowenstein–Jensen, est un colorant auquel Mycobacterium tuberculosis est relativement résistant : il supprime donc les contaminants d’un crachat tandis que le bacille tuberculeux survit. Le tellurite, employé dans le taurocholate de Monsur et dans les milieux au tellurite de potassium pour la diphtérie, est réduit par de nombreuses bactéries en un dépôt métallique toxique. Les antibiotiques servent de la même façon dans le milieu de Thayer–Martin, où la vancomycine, la colistine, la nystatine et le triméthoprime éliminent chacun une classe de concurrents. Une forte concentration de sel agit par osmose plutôt que par intoxication, et un pH alcalin fait le même travail chimiquement : l’eau peptonée alcaline favorise Vibrio, car les vibrions tolèrent une alcalinité qui supprime une grande partie de la flore fécale. Une boîte sélective n’aide toutefois que si l’organisme est présent en nombre détectable. C’est là qu’un bouillon d’enrichissement gagne sa place, et la raison tient à un rapport et non à un comptage total. Les selles contiennent peut-être cent millions d’organismes par gramme, et dans la typhoïde les Salmonella peuvent n’être que quelques centaines : un rapport d’environ un sur un million. Une boîte sélective peut supprimer les concurrents, mais elle ne peut pas multiplier la cible ; les quelques colonies de Salmonella qui apparaissent peuvent donc encore être manquées ou envahies. Un bouillon d’enrichissement modifie le rapport lui-même : dans le sélénite F, les concurrents sont inhibés et les Salmonella se divisent, si bien qu’après l’intervalle de repiquage le rapport peut approcher un sur mille, ce qu’une boîte sélective sait alors traiter. La même logique explique pourquoi le bouillon est repiqué après douze à dix-huit heures plutôt que laissé une journée entière : une incubation trop longue permet aux concurrents survivants de se multiplier et l’avantage est perdu. La traduction clinique est une leçon de lecture : une culture est une hypothèse, non un fait. Une boîte sélective répond à la question posée, et pas plus : la gélose mannitol-sel cultivera Staphylococcus aureus, mais aussi les staphylocoques à coagulase négative de la peau, et une colonie jaune n’est donc pas encore un diagnostic. La gélose MacConkey cultivera Salmonella, mais aussi tout autre bacille à Gram négatif non fermentant le lactose venu de l’intestin. C’est pourquoi le laboratoire avance par étapes — identification présomptive sur la boîte, puis confirmation biochimique, puis sérologie ou méthode moléculaire — et pourquoi l’infirmière ne doit jamais traiter un résultat de boîte isolément de la coloration de Gram, du site de prélèvement et de l’état du patient. Un milieu est un outil pour poser une question, et tout outil a ses limites.