Les milieux de culture : préparation et consistance

Une culture pure est une population issue d’un seul organisme, et séparer un organisme du mélange présent dans un prélèvement clinique est la première étape de presque toute identification. Un bouillon ne le permet pas, car chaque cellule peut dériver et entrer en contact avec les autres : après incubation, le tube contient une population mélangée, et rien dans l’aspect de ce trouble ne révèle combien d’espèces sont présentes. Une surface solide résout le problème en immobilisant physiquement chaque cellule. Lorsqu’une suspension diluée est étalée sur le gel, les bactéries se déposent en des points séparés ; chacune se divise sans se déplacer et ses descendantes s’accumulent en une colonie distincte. Si l’étalement était suffisamment dilué, chaque colonie provient d’une seule cellule : une colonie est donc un clone, une population d’organismes génétiquement identiques. Prélever une colonie à l’anse stérile ne transfère donc qu’une seule espèce dans le tube suivant, transfert appelé repiquage. La technique qui produit cette séparation est l’isolement par stries, et il s’agit d’une dilution réalisée à l’anse plutôt qu’à la pipette. Un petit volume du prélèvement est étalé sur un secteur de la boîte. L’anse est ensuite flambée ou remplacée, afin de ne plus porter d’organismes résiduels, puis elle est passée dans ce premier secteur et sur un deuxième, prélevant une fraction de la croissance et la répartissant sur de la gélose fraîche. L’opération est répétée pour un troisième puis généralement un quatrième quadrant, l’anse étant stérilisée entre les secteurs. Chaque passage dépose moins de cellules que le précédent : le dernier quadrant reçoit une concentration assez faible pour que des colonies bien espacées se développent, tandis que le premier secteur est souvent confluent, c’est-à-dire couvert d’un voile continu. Une boîte lue après une nuit à 37 °C montre donc des colonies isolées à la fin des stries et une croissance serrée au début, et les colonies isolées constituent le matériel de l’identification et de l’antibiogramme. Deux conséquences pratiques en découlent. D’abord, le mode de prélèvement compte plus que le milieu : si l’écouvillon est frotté en surface au lieu d’être pris dans la profondeur de la plaie, la boîte cultivera des commensaux cutanés et le clinicien pourra traiter une colonisation comme une infection. Ensuite, une culture n’est pure que si elle a été manipulée de façon aseptique ; une boîte non contaminée dépend d’une anse flambée, d’un récipient stérile et d’une hotte à flux laminaire, et un seul contact négligent introduit un contaminant qui sera plus tard signalé comme un second organisme. Robert Koch a introduit les milieux solides exactement dans ce but, et l’alternative plus ancienne, le bouillon solidifié à la gélatine dans une boîte plate, avait déjà montré le principe avant que l’agar ne remplace la gélatine.

La turbidité est le trouble d’un bouillon, et les débutants la lisent souvent comme un chiffre. Ce n’est pas une numération. L’appareil qui la mesure, le spectrophotomètre, fait traverser le tube par la lumière et affiche la densité optique ou l’absorbance, qui augmente à mesure que les cellules en suspension dispersent le faisceau. Cette lecture reflète la masse totale des particules présentes dans le trajet lumineux, vivantes ou mortes, bactériennes ou autres : une culture tuée par un antibiotique peut donc rester aussi trouble qu’une culture vivante. Deux tubes de même densité optique peuvent aussi contenir des nombres très différents si les cellules n’ont pas la même taille, et les amas dispersent la lumière autrement que les cellules isolées. La néphélométrie estime la même propriété à partir de la lumière dispersée et sert à préparer un inoculum standard, souvent calibré sur un étalon de sulfate de baryum de McFarland, afin que l’antibiogramme parte d’une densité reproductible. La numération des cellules viables est une mesure différente, et elle exige une surface. Dans le comptage des colonies, l’échantillon est dilué en série, un volume connu est étalé ou coulé sur une gélose, et les colonies apparues sont comptées après incubation. On suppose que chaque colonie provient d’une cellule vivante ou d’un petit amas, de sorte que le résultat s’exprime en unités formant colonie et non en bactéries : les deux termes ne sont donc pas interchangeables. La boîte donne le nombre d’organismes capables de se multiplier, ce qui compte cliniquement ; la lecture du bouillon ne sépare ni les vivants des morts, ni les cellules des débris. Lorsque le nombre attendu est très faible, la méthode du nombre le plus probable cultive l’échantillon dans une série de tubes de bouillon et estime la concentration à partir des tubes devenus troubles, ce qui reste une estimation et non une numération. Pourquoi donc utiliser un bouillon ? Parce que beaucoup de questions ne sont pas des questions de comptage. Les études de fermentation exigent un sucre et un indicateur de pH dissous dans le liquide, ainsi qu’un tube de Durham pour recueillir le gaz : la couleur et la bulle se lisent directement, alors que le même test sur une boîte donne un virage de couleur plus difficile à interpréter. L’identification biochimique, l’hémoculture, la production d’une biomasse abondante et homogène pour un antigène ou un vaccin, et la croissance d’organismes en vue d’un repiquage exigent du volume et du mélange plutôt qu’une séparation. Le bouillon présente aussi une limite importante que la boîte n’a pas : il ne montre pas la pureté. Un bouillon contaminé est simplement trouble, et une population mixte en milieu liquide ressemble exactement à une population pure jusqu’à ce qu’elle soit étalée sur une boîte et que les colonies soient examinées.

La consistance d’un milieu n’est pas une habitude de laboratoire ; c’est une décision qui découle de la question posée. Demandez si un seul organisme ou plusieurs sont présents : la réponse exige une surface, car seul un gel solide peut tenir séparées les descendantes d’une même cellule. C’est pourquoi l’isolement, la morphologie des colonies, les contrôles de pureté et la préparation d’une suspension standardisée pour l’antibiogramme se font avec 1,5 à 2,0 % d’agar. Demandez si un organisme peut se déplacer : la réponse exige un gel assez mou pour être traversé, raison pour laquelle la recherche de la mobilité et la culture des micro-aérophiles utilisent 0,5 % d’agar ou moins. Demandez quelle biomasse peut être produite, ou si un sucre est fermenté : la réponse exige un liquide, car un bouillon se mélange librement, accepte des réactifs dissous et s’adapte à tout volume. Les milieux de transport et de conservation constituent un quatrième cas, mais leur but est opposé. Les milieux de transport maintiennent les organismes vivants sans les laisser se multiplier : ils sont donc habituellement semi-solides ou liquides et volontairement pauvres en nutriments, ce qui évite la prolifération pendant l’acheminement du prélèvement vers le laboratoire. Les milieux de conservation visent l’inverse : ils maintiennent la viabilité d’une culture pendant des semaines ou des mois et contiennent donc souvent des nutriments — le bouillon de viande cuit, les milieux à l’œuf salé et les piqûres de gélose nutritive en sont les exemples classiques. Les propriétés physiques qui rendent ces choix possibles appartiennent à l’agar. L’agar est un polysaccharide formé d’unités répétées de galactose, et ses longues chaînes non ramifiées emprisonnent l’eau en un réseau qui se comporte comme un gel réversible : le chauffage rompt le réseau et le milieu devient liquide, le refroidissement le reconstruit et le milieu prend. Les deux températures sont très éloignées, environ 85–95 °C pour fondre et 40–45 °C pour prendre, et cette hystérésis est le vrai avantage pratique. Un milieu peut donc être stérilisé à 121 °C, maintenu fondu au bain-marie vers 50 °C, coulé dans des boîtes et laissé se solidifier sur la paillasse ; le gel pris reste ensuite ferme à l’étuve à 37 °C. Les notes indiquent à tort la température de prise, à la ligne 1138, comme étant 37 °C, et ne donnent qu’approximativement le même intervalle à la section 2.3 ; les valeurs ci-dessus sont celles à retenir. La gélatine, alternative plus ancienne, échoue ici parce qu’elle fond vers 35 °C et parce que de nombreuses bactéries sécrètent une gélatinase : la boîte se liquéfie à mesure que la culture pousse. Au-delà des notes fournies, trois autres choix se font à la paillasse. L’activité de l’eau, c’est-à-dire la disponibilité de l’eau libre et non sa teneur totale, détermine si un milieu permet la croissance : c’est pourquoi l’on ajoute du sel ou du sucre pour sélectionner des organismes halotolérants. Le pouvoir tampon détermine si une fermentation peut être détectée, car l’acide produit finirait par tuer la culture avant tout virage de couleur. Enfin, les agents sélectifs ou indicateurs transforment un même gel en plusieurs outils différents : un sel biliaire décourage les organismes à Gram positif, un colorant révèle un changement de pH et une couche de sang lysé montre l’hémolyse. Une même recette de base peut donc répondre à quatre questions différentes selon ce qu’on y dissout, et une infirmière qui le comprend lira le compte rendu du laboratoire comme la réponse à une question précise plutôt que comme une étiquette figée.