Compter les bactéries et les facteurs de croissance

Les microbiologistes disposent de mots précis pour les deux états décrits plus haut. Un prototrophe est une souche capable de pousser sur un milieu minimal — contenant seulement une source de carbone, des sels inorganiques et de l’eau — parce qu’elle sait synthétiser tous les composés organiques dont elle a besoin. Un auxotrophe est une souche incapable de pousser sur ce même milieu minimal, car elle a perdu la capacité de fabriquer un composé précis et doit le recevoir tout fait. Le mot auxotrophe vient du grec et signifie nourriture supplémentaire, exactement ce dont cette souche a besoin. La mutation qui crée un auxotrophe atteint habituellement un seul gène ; les lésions les plus courantes sont une substitution de base qui change un acide aminé de l’enzyme, une délétion ou une insertion qui décale le cadre de lecture, ou l’insertion d’un élément transposable au milieu du gène. L’enzyme peut alors être absente, malformée ou catalytiquement morte ; dans tous les cas, une étape de la voie s’arrête, et tout ce que la voie fabrique après cette étape est le composé qu’il faut désormais apporter. Les microbiologistes exploitent délibérément ce fait. Si l’on ajoute un composé candidat au milieu et que le mutant pousse, ce composé est soit le produit final manquant, soit un intermédiaire ultérieur de la voie : c’est la technique dite d’auxanographie, ou criblage des facteurs de croissance, qui a permis d’établir l’ordre des étapes de nombreuses voies de biosynthèse bien avant le séquençage des gènes. L’auxotrophie est aussi la base du test d’Ames pour les mutagènes et de nombreuses souches industrielles de fermentation, volontairement rendues auxotrophes pour qu’elles ne puissent pas survivre si elles s’échappent du fermenteur. Deux conséquences pratiques en découlent. D’abord, l’auxotrophie est une propriété de souche et non d’espèce : un isolat sauvage d’une espèce est généralement prototrophe, alors qu’un mutant de laboratoire de la même espèce peut être auxotrophe. Ensuite, un auxotrophe peut revenir en arrière, car une seconde mutation peut restaurer le gène atteint et la souche repousse alors sur milieu minimal ; c’est pourquoi les cultures de collection doivent être contrôlées et conservées avec soin plutôt que repiquées sans fin.

La numération viable courante est une chaîne de dilutions suivie d’un étalement, et chaque étape existe pour rendre les colonies finales comptables. Un volume mesuré du prélèvement — ordinairement 1 mL ou 0,1 mL — est ajouté à un volume connu de diluant stérile, par exemple du sérum physiologique ou une solution tamponnée de peptone, puis mélangé soigneusement. À partir de cette première dilution, le même volume est transféré dans un deuxième tube, et ainsi de suite. La série de dix est la plus courante : 1 mL de prélèvement dans 9 mL de diluant donne 10⁻¹, 1 mL de cette dilution dans 9 mL donne 10⁻², et ainsi de suite. Le mélange entre les étapes n’est pas facultatif ; un agitateur de type vortex, ou vingt-cinq allers-retours de pipette, est ce qui disperse les amas et rend chaque dilution réellement représentative de la précédente. Un volume fixe des dilutions choisies, généralement 0,1 mL, est ensuite étalé à la surface d’un milieu solide avec un râteau stérile, ou bien 1 mL est mélangé à de la gélose fondue puis refroidie et coulée dans une boîte. Les boîtes sont incubées à la température appropriée, 37 °C pour un prélèvement clinique, et les colonies sont comptées dès qu’elles sont visibles. Seules les boîtes portant un nombre comptable sont retenues : en dessous d’une trentaine de colonies, un seul contaminant ou une erreur de pipetage peut fausser l’estimation, et au-delà d’environ 300 colonies, l’encombrement empêche un comptage exact et les colonies voisines peuvent fusionner. Le nombre obtenu est ensuite corrigé de la dilution et du volume étalé, afin que le résultat soit exprimé par millilitre d’échantillon d’origine et non par boîte. On prépare habituellement des boîtes en double et l’on fait la moyenne des deux comptages ; si les deux chiffres divergent fortement, il faut mieux mélanger le prélèvement et recommencer. La technique paraît simple, et c’est précisément pour cela qu’elle est si facile à rater : une pipette non calibrée, un tube mal mélangé, un râteau utilisé sur une gélose inégalement séchée ou un délai avant l’incubation peuvent tous modifier le résultat sans qu’aucune erreur ne soit visible sur la paillasse.

Une numération viable se rend en unités formant colonie, abrégées UFC, car une colonie n’est pas la même chose qu’une cellule. Une UFC est la plus petite unité capable de produire une colonie visible : il peut s’agir d’une cellule unique, mais aussi bien de deux cellules encore jointes après la division, d’une chaîne de streptocoques, d’un amas de staphylocoques, d’un agglomérat de cellules collées par des protéines ou un biofilm, ou d’un filament de moisissure. Quelle que soit sa composition, l’ensemble donne naissance à exactement une colonie : la boîte compte donc des unités de croissance et non des individus, et c’est pourquoi le résultat s’écrit en UFC par millilitre et jamais en cellules par millilitre. La conversion vers l’échantillon d’origine est ce qui donne son sens au chiffre. Si une boîte a été inoculée avec 0,1 mL d’une dilution à 10⁻³ et que 42 colonies ont poussé, alors ces 0,1 mL contenaient 42 UFC ; 1 mL de la même dilution contenait 420 UFC ; et 1 mL de l’échantillon non dilué, mille fois plus concentré, en contenait 420 000, soit 4,2 × 10⁵ UFC par millilitre. Sous forme de formule, les UFC par millilitre égalent le nombre de colonies divisé par le produit du facteur de dilution et du volume étalé. Un chiffre non corrigé de cette façon n’a aucun sens pour le clinicien, car ces mêmes 42 colonies peuvent représenter de 42 à plusieurs millions d’organismes par millilitre selon la façon dont la boîte a été préparée. Le même raisonnement explique pourquoi une numération totale peut surestimer grossièrement la population vivante. Une numération microscopique directe en cellule de numération voit toute particule ayant la forme et les propriétés de coloration d’une bactérie, y compris les cellules tuées par un antibiotique ou un désinfectant, les cellules abîmées par la chaleur ou la dessiccation, et les cellules vivantes incapables de pousser sur le milieu proposé. Le trouble, lu comme densité optique au spectrophotomètre ou au néphélomètre, présente une faiblesse supplémentaire : il estime la biomasse totale, ne distingue pas du tout le vivant du mort et ne détecte une suspension que lorsqu’elle est dense — grossièrement au-delà de 10⁶ à 10⁷ cellules par millilitre — de sorte qu’un prélèvement contenant un petit nombre, mais cliniquement décisif, de pathogènes vivants peut paraître parfaitement limpide. Les deux approches répondent donc à des questions différentes, et un laboratoire qui rend une numération totale sans le préciser invite son lecteur à surestimer à la fois le nombre et le danger des organismes présents.

Parce qu’une exigence en facteur de croissance est une propriété stable et vérifiable d’une souche, elle est consignée et conservée au lieu d’être redécouverte dans chaque laboratoire. Une collection de cultures — appelée aussi collection de référence ou collection type — est un conservatoire qui acquiert, authentifie, préserve et distribue des souches de référence. Les exemples les plus connus sont l’American Type Culture Collection, dont les numéros de catalogue commencent par ATCC, la National Collection of Type Cultures au Royaume-Uni et la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen en Allemagne. Lorsqu’une nouvelle espèce est décrite, une souche est désignée comme souche type, référence permanente à laquelle tous les isolats ultérieurs sont comparés, et elle est déposée dans au moins deux collections de pays différents afin de rester disponible même si un laboratoire ferme. La collection vérifie que le dépôt est bien ce qu’il prétend être — son identité, sa pureté et ses propriétés, y compris toute exigence en facteur de croissance — puis le conserve par lyophilisation ou par stockage dans l’azote liquide, de sorte que la souche ne dérive pas au fil des repiquages. Les catalogues indiquent ces exigences clairement, par exemple « exige l’acide nicotinique » ou « pousse sur milieu minimal ». Il ne s’agit pas de comptabilité gratuite. Une auxotrophie documentée indique au laboratoire suivant quel milieu fera pousser l’organisme, ce qui est indispensable lorsqu’une souche sert à tester un nouvel antibiotique, à valider un lot de milieu de culture, à préparer un vaccin ou à jouer le rôle d’organisme de contrôle qualité dans un programme d’accréditation. Cela évite aussi un échec silencieux : un laboratoire annonce qu’un organisme n’a pas poussé et accuse le prélèvement, alors que le milieu manquait du seul composé que la souche ne sait pas fabriquer. Les exigences en facteurs de croissance comptent autant en pratique clinique qu’industrielle : ce sont elles qui obligent des organismes comme Haemophilus influenzae à trouver des facteurs d’origine sanguine dans le milieu, et elles sont introduites volontairement dans les souches de production pour que l’organisme ne puisse pas s’échapper du fermenteur. Le dépôt d’une souche dans une collection est également une obligation légale pour breveter une invention biologique au titre du traité de Budapest, ce qui explique que ces mêmes conservatoires détiennent des souches introuvables ailleurs. Pour toutes ces raisons, la capacité ou l’incapacité de synthétiser un composé précis fait partie de la description officielle d’un organisme, aux côtés de sa forme, de sa coloration et de ses exigences en oxygène.