Critères utilisés pour identifier les bactéries

Classer et identifier sont deux opérations distinctes, et les confondre est l’erreur la plus fréquente dans ce chapitre. Classer, c’est construire le schéma lui-même. Les taxonomistes caractérisent les souches, les rangent dans une hiérarchie de rangs — espèce, genre, famille, ordre, classe, embranchement, règne et domaine — et donnent à chaque taxon accepté un nom valide selon la nomenclature binomiale : le genre prend une majuscule, l’espèce s’écrit en minuscules et l’ensemble est en italique. La taxonomie bactérienne moderne est dite polyphasique : le même organisme est jugé sur des caractères phénotypiques (morphologie, coloration, biochimie, antigènes), génotypiques (composition en bases de l’ADN, hybridation ADN–ADN, séquences de gènes) et sur sa position phylogénétique, de sorte qu’une nouvelle espèce ne se propose jamais sur un seul test. Les anciennes écoles utilisaient des clés dichotomiques, où chaque test partage l’inconnu en deux branches, et la taxonomie numérique, où de nombreux caractères de poids égal sont comparés et les souches regroupées par pourcentage de similitude. Les souches de référence, dites souches types, sont déposées dans des collections publiques comme l’American Type Culture Collection ou la National Collection of Type Cultures, et leurs descriptions sont résumées dans des ouvrages de référence tels que le Bergey’s Manual, précisément pour qu’un laboratoire d’un pays et un laboratoire d’un autre pays nomment la même chose. Identifier va en sens inverse : on place un isolat inconnu dans un taxon qui existe déjà. En routine, il s’agit d’une comparaison et non d’une découverte : le laboratoire réalise une série de tests standard et compare le profil obtenu à un tableau de profils connus. La conséquence clinique est qu’un compte rendu peut légitimement s’arrêter à des niveaux différents. « Escherichia coli » est une identification au niveau de l’espèce ; « coliforme » ou « entérobactérie » est une indication de niveau classement, souvent suffisante au prescripteur pour choisir un traitement empirique, alors qu’un nom d’espèce devient déterminant lorsqu’il change la thérapeutique, comme pour Salmonella Typhi ou un Klebsiella résistant aux carbapénèmes. L’infirmière qui lit un compte rendu doit donc se demander quel degré de certitude représente le nom : une réponse au niveau du genre signifie souvent que le laboratoire n’a pas pu séparer deux espèces avec les méthodes dont il dispose, et non que l’identification a échoué.

Ce qu’une séquence ne peut pas dire. La réponse courte est que les méthodes moléculaires répondent à une autre question que celle que pose le plus souvent le clinicien. Une réaction de polymérisation en chaîne ou une séquence de gène détecte un acide nucléique. Elle indique qu’un ADN est présent ; elle ne dit pas si l’organisme est vivant, s’il est présent en quantité significative, ni quel antimicrobien le tuera. Les bactéries mortes libèrent de l’ADN qui persiste plusieurs jours : un signal positif après un traitement réussi est donc fréquent et ne prouve pas, à lui seul, un échec.

Pourquoi la sensibilité exige une culture. L’antibiogramme, au contraire, exige un isolat vivant : la diffusion en disque mesure la zone d’inhibition de la croissance, la dilution en bouillon mesure la concentration minimale inhibitrice qui arrête la croissance visible, et ni l’une ni l’autre ne peut se pratiquer sur une séquence. Seuls quelques mécanismes de résistance sont prévisibles à partir d’un gène unique — le gène mecA de Staphylococcus aureus résistant à la méticilline et le gène blaKPC des carbapénémases en sont de bons exemples — tandis que beaucoup de résistances résultent de plusieurs gènes agissant ensemble, de pompes d’efflux ou d’une perte de porines : génotype et phénotype ne concordent donc pas toujours.

Mélanges et enrichissement. La culture sépare aussi un mélange : un crachat ou une plaie peuvent contenir trois ou quatre espèces, et un test moléculaire réalisé directement dessus donne un signal global, alors que la boîte les isole physiquement. Elle concentre un organisme minoritaire : la coproculture à la recherche de Salmonella utilise un enrichissement sélectif, car le pathogène peut être mille fois moins nombreux que la flore normale, et le seuil classique de 10⁵ unités formant colonie par millilitre d’urine reste un guide utile pour distinguer une bactériurie significative d’une contamination, même si des numérations plus basses peuvent être significatives chez un patient symptomatique.

Quand la culture reste la référence. La culture fournit la colonie pure que la spectrométrie MALDI-TOF et le séquençage du génome entier identifient ensuite, et elle procure l’isolat vivant dont un laboratoire de référence a besoin pour le typage épidémique, le travail vaccinal et la biobanque congelée que les enquêtes futures utiliseront. Elle reste la méthode de référence pour Mycobacterium tuberculosis et demeure, dans beaucoup de laboratoires, la seule option abordable, car les plateformes moléculaires exigent des réactifs, une électricité stable et une chaîne du froid. Enfin, un panel moléculaire ne détecte que ce que ses amorces sont conçues pour détecter, et des inhibiteurs présents dans le sang ou le pus peuvent supprimer la réaction et donner un faux négatif. La conclusion pratique n’est pas qu’une méthode remplace l’autre, mais qu’elles sont complémentaires : les tests moléculaires raccourcissent le délai jusqu’au nom, tandis que la culture conserve l’organisme vivant sur lequel reposent encore les décisions thérapeutiques.

Tout ce sujet dépasse les notes fournies, qui s’arrêtent à l’expression « technique spécialisée de biologie moléculaire ». La réaction de polymérisation en chaîne copie un fragment choisi d’ADN. Le mélange réactionnel contient l’ADN de l’échantillon, deux courtes amorces qui encadrent la cible, les quatre nucléotides constitutifs, une ADN polymérase thermostable (la Taq, initialement isolée de Thermus aquaticus) et un tampon. Le mélange est placé dans un thermocycleur et soumis à des cycles répétés : environ 95 °C sépare les deux brins d’ADN, étape dite de dénaturation ; environ 50 à 65 °C laisse les amorces se fixer à leur séquence complémentaire, étape d’hybridation ; et environ 72 °C permet à la polymérase de prolonger les amorces, étape d’élongation. Chaque cycle double la cible, si bien que 30 à 40 cycles transforment quelques copies en millions : c’est cette augmentation exponentielle qui permet de détecter un organisme présent en très petit nombre. En PCR en temps réel, le produit accumulé est mesuré par fluorescence, et le cycle où le signal franchit le seuil — la valeur Ct — diminue à mesure que la quantité initiale de cible augmente, ce qui rend le test approximativement quantitatif. Pour l’identification, la cible habituelle est le gène de l’ARN ribosomal 16S, long d’environ 1 500 paires de bases. Il contient des régions conservées, presque identiques chez la plupart des bactéries, qui permettent aux amorces universelles de l’amplifier chez presque toutes les espèces, et neuf régions hypervariables intercalées, dont les différences portent le signal d’espèce. Le produit est séquencé puis comparé à des bases de données curées ; une similitude d’au moins 98,7 % avec une souche type est généralement acceptée comme un accord au niveau de l’espèce, alors que 95 à 98,7 % ne suggère qu’un rattachement au genre. Ces valeurs sont des conventions et non des lois : l’ancien seuil de 97 % proposé en 1994 a été remplacé à mesure que les séquences s’accumulaient, ce qui montre bien que l’identification dépend de la base de données de référence. La même approche 16S, appliquée par Carl Woese dans les années 1970, a révélé que les archées forment un domaine distinct du vivant, et en clinique elle identifie des organismes que la culture n’a pas réussi à faire pousser, comme la cause des endocardites à hémoculture négative. La spectrométrie de masse MALDI-TOF fonctionne autrement et beaucoup plus vite. Une colonie est mélangée à une matrice, séchée sur une plaque cible et frappée par un laser ; la matrice absorbe l’énergie et ionise surtout des protéines ribosomiques, qui traversent un tube sous vide et sont séparées par le temps qu’elles mettent à atteindre le détecteur. Le spectre de pics rapport masse/charge ainsi obtenu est une empreinte reproductible ; un logiciel le compare à une bibliothèque de spectres de référence et rend un score : environ 2,0 ou plus est accepté au niveau de l’espèce, à peu près 1,7 à 2,0 au niveau du genre. L’identification d’une colonie prend alors quelques minutes au lieu d’une journée : c’est pourquoi une infirmière peut apprendre qu’une hémoculture a cultivé Escherichia coli quelques heures après le signalement du flacon positif. Aucune de ces méthodes ne remplace l’antibiogramme : toutes deux nomment l’organisme, mais toutes deux partent encore d’une colonie cultivée.