La paroi cellulaire et la coloration de Gram

Le peptidoglycane, appelé aussi muréine, est une molécule géante tissée autour de toute la bactérie. Son squelette est fait de deux amino-sucres alternés, la N-acétylglucosamine et l’acide N-acétylmuramique, réunis en longs brins de glycanes. De courtes chaînes peptidiques pendent des unités d’acide muramique, et les brins voisins sont attachés par des ponts entre ces chaînes ; chez Staphylococcus aureus, un pont de pentaglycine les relie, et l’enzyme qui forme cette liaison est une transpeptidase ancrée dans la membrane. La pénicilline et les autres bêta-lactamines imitent l’extrémité de la chaîne peptidique, occupent la transpeptidase et empêchent les nouvelles liaisons : une bactérie en croissance construit alors une paroi percée et éclate. Le lysozyme, enzyme présente dans les larmes et la salive, attaque la même couche autrement, en coupant la liaison entre les deux amino-sucres. La paroi Gram positif est en outre traversée d’acides teichoïques, polymères chargés négativement qui aident à fixer les cations et que l’on ne trouve pas chez les Gram négatif. L’épaisseur de ce maillage explique la coloration. L’alcool déshydrate le peptidoglycane et le contracte ; dans une paroi épaisse, les pores se ferment et le volumineux complexe violet–iode reste physiquement piégé, alors qu’une paroi mince a trop peu de matière pour se refermer autour de lui. Chez les Gram négatif, l’alcool dissout en plus la membrane externe riche en lipopolysaccharides et en extrait les lipides, si bien que le colorant sort librement. C’est pourquoi l’étape de décoloration, et non le colorant, décide de la réaction de Gram, et pourquoi le temps et l’épaisseur du frottis sont les deux variables les plus surveillées au laboratoire. Cela explique aussi la variabilité de Gram : une culture âgée dont la paroi commence à s’autolyser retient mal le colorant et donne un résultat ambigu.

Lorsque des bactéries Gram négatif se multiplient dans le sang, la partie lipidique A de leur lipopolysaccharide est le signal qui transforme un problème local en problème général. Le lipide A se fixe sur des récepteurs des monocytes et des macrophages et leur fait libérer des cytokines — facteur de nécrose tumorale, interleukine-1 et interleukine-6 — dans la circulation. Ces cytokines agissent sur l’hypothalamus pour élever la température corporelle, ce qui provoque la fièvre et les frissons, et elles font dilater les vaisseaux. La vasodilatation généralisée abaisse les résistances vasculaires systémiques : la pression artérielle chute même si le cœur s’accélère ; les capillaires laissent fuir du liquide dans les tissus, et l’association de vasodilatation, de fuite capillaire, de microthrombose et de mauvaise perfusion tissulaire produit le choc septique. Le lactate monte à mesure que les tissus manquent d’oxygène, et une dépression du myocarde peut suivre. L’endotoxine n’est pas détruite par l’ébullition et n’est pas neutralisée par les antibiotiques ordinaires ; tuer les bactéries peut même en libérer une nouvelle vague, ce qui explique que le choc septique puisse s’aggraver dans les premières heures d’un traitement pourtant correct. Les organismes Gram positif peuvent aussi provoquer des infections sanguines graves, mais leur comportement local est différent. Beaucoup d’entre eux — Staphylococcus aureus et Streptococcus pyogenes sont les exemples classiques — provoquent une collection enkystée de polynucléaires et de tissu mort, un abcès, et le pus reste localisé jusqu’au drainage. Ils sécrètent des enzymes comme la coagulase qui font coaguler le plasma autour de l’infection, et des exotoxines qui agissent à distance. La différence pratique pour l’infirmière tient donc au tableau à surveiller : une infection Gram négatif peut se présenter par de la fièvre, une pression artérielle qui baisse, une respiration rapide et de la confusion alors que le site d’origine semble peu impressionnant, tandis qu’une infection Gram positif se manifeste souvent par un foyer douloureux, gonflé et suppurant. Les deux exigent la même discipline : prélever avant les antibiotiques, traiter rapidement et répéter la mesure des signes vitaux.

Un compte rendu de coloration de Gram ne vaut que ce que vaut le frottis dont il provient, et plusieurs problèmes très différents peuvent le rendre illisible. La variable de laboratoire la plus fréquente est la décoloration : trop d’alcool, ou un alcool laissé trop longtemps, enlève le violet même des cellules Gram positif, si bien que tout paraît Gram négatif ; trop peu d’alcool laisse le violet dans les cellules Gram négatif, et tout paraît Gram positif. Ces deux erreurs se contrôlent en traitant une lame de référence positive et une lame négative connues en même temps que le prélèvement du patient, et en gardant un temps constant. L’épaisseur du frottis compte autant : un film épais et dense retient le colorant et se décolore irrégulièrement, si bien que des parties du même champ se contredisent. Un prélèvement très pauvre — peu d’organismes dans un grand volume de liquide — peut simplement ne rien contenir à voir, surtout au début d’une méningite, où le liquide céphalorachidien peut être clair et la coloration négative alors que le patient est infecté ; une coloration négative n’exclut jamais une infection. L’organisme lui-même peut tromper. Les espèces Gram variables, comme certains Bacillus et Clostridium, et les cultures âgées dont la paroi commence à s’autolyser, se colorent faiblement et de façon inconstante. Mycobacterium tuberculosis possède une paroi cireuse, riche en acides mycoliques, qui résiste aux colorants et n’est pas visible sur une coloration de Gram ordinaire ; il faut la méthode de Ziehl–Neelsen. Mycoplasma n’a pas de paroi ; les spirochètes comme Treponema pallidum sont trop fins pour être résolus en microscopie optique à fond clair et exigent un fond noir ou des colorations spéciales. Les antibiotiques déjà administrés faussent le tableau en réduisant le nombre de bactéries ou en modifiant leur forme. Le contenu du prélèvement gêne aussi : le sang, le mucus, la mucine, les débris inflammatoires et l’hémolyse peuvent masquer les organismes ou laisser un précipité qui les imite. Enfin, l’interprétation dépend de l’observateur, d’où le recours des laboratoires à un personnel formé, à des procédures écrites, à des contrôles de compétence et à une lame témoin dans chaque série. Pour l’infirmière, les messages sont concrets : prélever avant les antibiotiques, envoyer sans délai, étiqueter complètement, et considérer une coloration négative comme un élément de preuve et non comme la preuve qu’il n’y a pas d’infection.

Une fois la couleur connue, la seconde information est la morphologie, et leur combinaison réduit le champ bien plus que ne l’imaginent les débutants. Des coques Gram positif en amas évoquent Staphylococcus ; en chaînettes, Streptococcus. Des bacilles Gram positif dans une plaie peuvent être des diphtéroïdes ou des Clostridium. Des diplocoques Gram négatif à l’intérieur des polynucléaires du liquide céphalorachidien évoquent fortement Neisseria meningitidis, et des diplocoques Gram négatif dans un prélèvement urétral évoquent Neisseria gonorrhoeae. Les bacilles Gram négatif ouvrent un large diagnostic différentiel qui comprend Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa et bien d’autres, sans que la coloration puisse les séparer. De gros bacilles Gram positif à spore centrale font penser à Bacillus anthracis dans le bon contexte, mais la spore ne l’identifie pas. C’est pourquoi la coloration est dite présomptive : elle appuie un diagnostic probable et guide le traitement empirique, tandis que le nom définitif vient de la culture et de l’identification. Au laboratoire, l’identification peut utiliser des réactions biochimiques, la détection d’antigènes, la sérologie, la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF, ou des méthodes moléculaires comme la réaction de polymérisation en chaîne et le séquençage de l’ARN ribosomique. L’étude de la sensibilité mesure ensuite quels médicaments arrêtent la souche. Deux habitudes en découlent pour l’infirmière. D’abord, la coloration et la culture sont complémentaires et non interchangeables : le prélèvement doit être recueilli avant le premier antibiotique et transporté sans délai dans le bon contenant. Ensuite, un compte rendu préliminaire n’est pas un diagnostic définitif : il doit déclencher le bon traitement et les bonnes précautions, mais aussi une question — le patient correspond-il à ce tableau ?