Les premiers microscopistes : Hooke et Leeuwenhoek

Le grossissement et la résolution sont deux propriétés différentes, et les confondre est l’erreur la plus fréquente en microscopie. Le grossissement indique simplement combien de fois l’image est plus grande que l’objet ; c’est un rapport, que l’on peut augmenter presque sans limite en ajoutant des lentilles. La résolution, ou pouvoir séparateur, est la plus petite distance entre deux points distincts à laquelle ils restent perçus comme deux points et non comme une seule tache floue. Pour un microscope optique, cette limite dépend de deux facteurs : la longueur d’onde de la lumière visible utilisée, environ 400 à 700 nanomètres, et l’ouverture numérique de l’objectif, qui décrit l’ampleur du cône de lumière que la lentille peut capter. La valeur classique est d’environ 0,2 micromètre, soit 200 nanomètres, pour le meilleur microscope optique ; en dessous, deux organismes se confondent en une seule image, quelle que soit l’augmentation.

Pousser le grossissement au-delà de 1 000 à 1 500 fois produit ce que les microscopistes appellent un grossissement vide : l’image devient plus grande sans révéler de détail nouveau. C’est pourquoi les petites lentilles uniques de Leeuwenhoek, grossissant de 50 à 300 fois, pouvaient surpasser les microscopes composés de son époque, qui grossissaient davantage mais souffraient d’aberration chromatique et sphérique — des franges colorées et un flou introduits par le passage de la lumière à travers plusieurs lentilles. Une seule petite lentille tenue près de l’œil, le spécimen la touchant presque, donnait au contraire une image lumineuse et nettement mise au point.

La même physique explique la routine moderne du laboratoire : les bactéries, larges de 0,5 à 2 micromètres, s’examinent avec un objectif à immersion à 1 000 fois, l’huile d’immersion augmentant l’ouverture numérique et donc la résolution ; les virus, mesurés en nanomètres, ne peuvent être résolus par aucun microscope optique et exigent la microscopie électronique, dont la longueur d’onde électronique bien plus courte abaisse la limite à environ 0,2 nanomètre. Pour l’infirmière, la conséquence est pratique : une coloration de Gram rendue « aucun organisme vu » signifie qu’aucun organisme assez grand pour être résolu par le microscope optique n’était présent dans ce champ — cela n’exclut pas un virus et ne signifie pas que le prélèvement était stérile.

Les objets que Hooke a dessinés en 1665 n’étaient pas des micro-organismes, et la distinction n’est pas une chicane. Le liège est l’écorce externe du chêne-liège, un tissu fait de cellules végétales mortes dont le contenu a été remplacé par une substance cireuse et imperméable ; les parois qui subsistent sont donc constituées surtout de cellulose et de subérine. Ce que l’instrument de Hooke, grossissant environ 30 fois, montrait était un alvéole de compartiments vides : les parois rigides d’un tissu végétal mort, la matière vivante ayant disparu. Le mot qu’il a choisi, cellule, vient du latin cellula, « petite chambre » : il décrivait une architecture, non la vie.

Les animalcules de Leeuwenhoek étaient l’inverse — des organismes entiers et vivants, qui nageaient, changeaient de forme, se divisaient et réagissaient, ce qui permettait de les appeler à juste titre de petits animaux. Une cellule vivante, au sens de ce cours, doit posséder une membrane qui contrôle les entrées et les sorties, un cytoplasme où se déroule le métabolisme, un génome et une machinerie pour fabriquer des protéines ; Hooke n’a rien vu de tout cela. La confusion se comprend d’autant mieux que le même mot porte aujourd’hui une découverte plus tardive : en 1838 et 1839, le botaniste Matthias Schleiden et le zoologiste Theodor Schwann ont soutenu que tous les végétaux et tous les animaux sont faits de cellules, et Rudolf Virchow a ajouté en 1855 que toute cellule provient d’une cellule préexistante.

C’est la théorie cellulaire, une affirmation sur les unités vivantes, publiée plus de 170 ans après que Hooke eut dessiné une tranche de bouchon de liège. La différence compte encore au laboratoire clinique : une coloration de Gram ou une culture recherche des organismes vivants, capables de métabolisme et de croissance, tandis qu’un échantillon de tissu mort, de bois ou de liège ne montre au même microscope que des parois vides.

Une lentille fonctionne parce que la lumière se courbe en traversant la frontière entre l’air et le verre. Une lentille biconvexe — plus épaisse au centre qu’au bord — courbe les rayons issus de chaque point d’un objet pour qu’ils se réunissent de l’autre côté et forment une image ; la distance à laquelle cette image se forme est la distance focale. Plus la distance focale est courte, plus la lentille doit être proche de l’objet et plus l’agrandissement est grand ; les meilleures lentilles de Leeuwenhoek étaient de minuscules perles de verre dont la distance focale dépassait à peine un millimètre, ce qui explique qu’une lentille unique ait pu atteindre 300 fois. Une distance focale courte a cependant un prix.

La profondeur de champ devient extrêmement faible : seul un plan très mince du spécimen est net à la fois, et le spécimen doit être mince et translucide, car la lumière doit le traverser. Leeuwenhoek taillait et polissait lui-même ses lentilles, montait ses spécimens sur des épingles et les éclairait à la bougie ou à la lumière du jour dirigée par un petit miroir, ajustant la position par des vis jusqu’à obtenir une image nette. Les microscopes composés de l’époque, avec deux lentilles séparées par un tube, grossissaient plus commodément mais souffraient d’aberration sphérique et chromatique — un flou et des franges colorées produits par la courbure et par le fait que les différentes couleurs de la lumière se courbent différemment.

Une perle de verre unique évitait la majeure partie de cette distorsion : c’est pourquoi l’amateur de Delft, et non les grands fabricants d’instruments de Londres, a vu le premier les bactéries. La leçon pour le laboratoire moderne est qu’une technique dépasse un appareil : la lumière, la préparation du spécimen, la profondeur de champ et l’habileté de l’observateur déterminent tous si une structure peut finalement être vue ; c’est pourquoi les procédures opératoires normalisées les décrivent toutes, et pas seulement l’instrument.